Історія геноміки: ДНК технології

Перш ніж розповісти історію появи нових методів секвенування хочеться розповісти про декілька надзвичайних технологіях пов'язаних з ДНК, які з'явилися зовсім недавно в піку розвитку геноміки. На Рис. 1 показані зображення, отримані шляхом самосборки ДНК. Таких картинок в пробірці може бути мільйони і вони утворюються самі при правильному підборі умов [1]. Ці роботи з'явилися в 2006-му році і отримали назву "ДНК-орігамі", в більш загальному вигляді "ДНК-нанотехнології".

Мал. 1 Знімки упорядкованих структур, складених з молекул ДНК під електронним мікроскопом

Але для розвитку геноміки ключову роль грає інший тип технологій - технології секвенування, читання геномів. Ми вже розібрали метод Гілберта-Максама 1973 його року, наступний за ним метод термінації ланцюга Сенгера 1975-ого року і покращений худому метод Сенгера 1985-року, який дозволив створити перші автоматичні секвенатори. Як показала історія генома людини, ці методи і раніше були дуже дорогі і повільні - перший геном людини коштував більше 3 мільярдів доларів і посів 13 років. На початку XXI століття була досягнута межа секвенаторов терминирующего ланцюг: в одному капілярі можна прочитати тисячі букв за 1 годину за ціною $ 1, в одній машині до 100 капілярів. Ціна $ 1 насправді мінімальна - в Росії ті самі 1000 букв читають за 15-20 $.

Сьогодні з'являються все нові і більш досконалі методи секвенування, які можна розбити на дві групи. Старі методи засновані на всіляких витончених способах отримання великої кількості однакових молекул ДНК на певному носії, для посилення сигналу при читанні молекули ДНК. Найбільш пізні методи засновані на розробці надточних приладів, здатних аналізувати поодинокі молекули.

Перш ніж розповідати про перший тип приладів, необхідно розібрати так звану "полімеразної ланцюгової реакції" (ПЛР), яка дозволяє розмножити одну єдину молекулу ДНК до мільйона або навіть мільярди копій. Технологія була розроблена в 1984-1986 роках Кері Мулліс [2]. При високій температурі (близько 95-и градусів) молекула ДНК денатурує: перетворюється з двухцепочечной молекули в дві одноцепочечниє. При більш низькій температурі (зазвичай це 40-60 градусів), до одноцепочечной молекулі ДНК може приєднається короткий фрагмент - праймер, який по своїй послідовності комплементарен приблизно 20-й нуклеотидам довгою молекули ДНК. При температурі близько 72 градусів спеціальний фермент - ДНК полімераза, виділена з бактерій, що живуть в гарячих джерелах, може добудувати одноцепочечную молекулу ДНК, до якої приєднався праймер до двухцепочечной. Якщо ми знаємо послідовність 20 нуклеотидів в лівій частині великої молекули ДНК і в правій її частині, то ми можемо, використовуючи два праймера (зліва і справа), розмножити експоненціально фрагмент ДНК. Для цього треба циклічно нагрівати суміш реагентів до 95 градусів (денатурація), охолоджувати до 60 (отжиг праймерів), нагрівати до 72 (добудова ланцюга) і знову денатурувати (температура вказана приблизно і залежить від конкретних праймерів і полімерази). Схематично це зображено на Рис. 2. Дивно, але для успішної реакції ПЛР теоретично досить мати одну єдину молекулу "матриці", тобто можна взяти ДНК з однієї клітини і розмножити будь-який фрагмент її ДНК в будь-яку кількість разів.

Мал. 2 Три циклу полімеразної ланцюгової реакції. Темно-червоним і темно-зеленим показані праймери.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР):
</ Lj-embed>

Мал. 3 Технологія 454. Використовуються кульки розміром 44нм, на яких розмножуються молекули ДНК.

У тому ж 2005-му році лабораторією Джорджа Черча [4] був запропонований інший метод з використанням точно таких же кульок, тільки меншого розміру. Такі кульки, розміром з мікрон і зберігають на собі безліч ідентичних копій молекули ДНК приліплюють до спеціального скельце. Далі додають суміш праймерів виду XNNNNNNNN, де N - будь-яка буква, а X - відома буква, пофарбована певним кольором (4 кольори на кожну букву). Не вдаючись в деталі, скажемо лише, що від того, якого кольору праймери прилипають до кожного кульці ми дізнаємося, яка буква знаходиться на цьому кульці. Праймери виду XNNNNNNNN вказують першу букву, NXNNNNNNN другу і так далі. Ціна приблизно в 9 разів менше, ніж ціна секвенування по Сенгеру.

Третій оригінальний метод читання ДНК запропонований компанією Illumina в 2005-му році і реалізований у вигляді платформи Solexa [5] на шляху до плану "$ 1000 доларів - один геном". Молекула ДНК розрізається, і до неї пришиваються з обох сторін два різних адаптера. На спеціальне скельце приклеюються точно такі ж адаптери, які послужать праймерами. Молекул ДНК береться мало, і вони прилипають у випадковому місці скельця, після чого додають ферменти, необхідні для ПЛР. Оскільки все праймери приліплені до скельця, то все нові копії молекули ДНК будуть утворюватися поруч на скельце. Так навколо кожної вихідної молекули ДНК виростає цілий "ліс" (Рис. 4) однакових молекул і таких кластерів утворюються мільйони. Далі додають вільно-плаваючі праймери і мічені різними кольорами терминирующего нуклеотиди всіх 4 типів - так до кожної молекулі ДНК приєднається праймер і тільки 1 нуклеотид, колір якого можна визначити за допомогою лазера. Потім нуклеотид хімічно модифікують, щоб до нього міг прилипнути наступний терминирующего нуклеотид і так далі.

Мал. 4 Illumina Solexa - кластери ДНК.

Але навіть з часів цих нових секвенаторов багато вже встигло змінитися. Сучасні детектори досягли можливості реєструвати сигнали, отримані від окремих молекул, що зняло завдання посилення сигналу, шляхом ампліфікації ДНК (як це робили, використовуючи Solexa або 454). Починаючи з 2008-го на питання "як читають послідовність молекули ДНК?" Вже можна відповісти "беремо молекулу і читаємо". Компанія Helicos розробила секвенатор нового покоління [6]. За новим методом ДНК ріжеться на частини і до одного з кінців фрагмента прилаштовують довгу послідовність з букв "А" за допомогою спеціального ферменту, а в кінці ставлять світиться мітку. На спеціальному скельце приклеєні молекули ДНК, що складаються з безлічі букв "T". Коли зразок виливають на скельце, то молекули ДНК прилипають ділянкою з нуклеотидів "А" до стирчить з скельця нуклеотидами T за принципом комплементарності. Далі спеціальний мікроскоп сканує скельце і за світінням мітки знаходить положення кожної прилип молекули ДНК (Рис. 5). Мітку відмивають і додають по черзі кожен з 4-ох типів нуклеотидів з міткою. Знову дивляться світіння молекул і знову відмивають мітку і приєднують наступний нуклеотид. Спеціальний комп'ютер записує становище мільйонів спалахів після кожної реакції. Така система дозволяє читати мільярди нуклеотидів в день.

Мал. 5 Технологія Helicos. Кожна крапка, що світиться - окрема молекула ДНК!

Секвенування за допомогою Helicos.

Але і це виявилося не межа. У 2009-му році з'являється революційно новий метод читання ДНК з використанням тих же самих механізмів, які використовує клітина - ДНК полімерази. Прилад, розроблений в лабораторії Стівена Тернера дійсно унікальний [7]. На дно спеціальних осередків, розташованих на прозорому склі, прикріплюються поодинокі молекули ДНК-полімерази, ферменту, який подвоює ДНК в клітині (Рис. 6). Область нікчемного розміру прямо навколо закріпленого ферменту просвічується за допомогою спеціального лазера. У осередок додають нуклеотиди всіх 4-х типів, помічені різними світяться маркерами. Область, яку аналізує лазер, настільки мала, що молекула в нормі не затримується в ній довго, спливає і не залишає сигналу. Якщо ж під час подвоєння ДНК молекула утримується полимеразой, то молекула затримується в області, що сканується і залишає сигнал. Після приєднання нуклеотиду світиться мітка відвалюється і спливає. Таким чином, швидкість читання у такого приладу стає рівною швидкості роботи полімерази.

Мал. 6 Технологія SMART Pacific Biosciences - читання одиночних молекул, під час їх проісоедіненія до наростаючої ланцюга ДНК за допомогою ДНК полімерази.

Відео Pacific Biosciences можна подивитися тут: www.pacificbiosciences.com/video_lg.html

Таким чином, за останні 10 років стався переворот в можливості читання геномів. Ціна секвенування впала з менш $ 1 н1000 нуклеотидів за методом Сенгера в 90-их до 0.05 $ з технологією 454 в 2005, потім в тому ж році до $ 0.002 з технологією Illumina і, нарешті, 0.0005 $ з технологією Helicos. Ціна читання ДНК з найостаннішими секвенатор компаній Complete Genomics і Pacific Biosciences, які, ймовірно з'являться на ринку в цьому і наступному році ще не відомі, але прогнози досить оптимістичні.

Виникає питання: а що дала і зможе дати людям геномика? Відповідь проста: дуже багато. Прочитані геноми дають основу для побудови еволюційних дерев, що допоможе розібратися в тому, як саме йшла еволюція живих організмів на нашій планеті. Коли вартість читання геномів тварин наблизиться до порога 1000 $ / геном, стане можливим прочитати геноми всіх живих організмів, досліджувати будь-які родинні взаємини між будь-якими групами живих організмів - поява нової систематики.

По-друге, ми дізнаємося все більше і більше про роль наших генів. Завдяки проекту генома людини ми знаємо, що не кількість генів робить нас відмінними від інших тварин, а їх якість, особливості. Порівнюючи геноми різних тварин, вишукуючи гени, ми можемо дізнатися, за що відповідає кожен з них, а може навіть поліпшити той чи інший ген, щоб вивести новий, більш пристосований організм. Генетичні дані активно використовуються при створенні медичних препаратів або нових сільськогосподарських культур.

Останні дослідження з вивчення одиночних мутацій в генах показують зв'язок між певними генетичними варіаціями і різними захворюваннями і рисами. Так існують гени, що визначають те, чи станемо ми лисіти, який у нас колір очей, зріст, наскільки нам загрожує діабет або певна форма раку, чи є у нас схильність до спорту, чи корисно для нас прийняття кави, алкоголю або аспірину. З 2007-го року стали з'являтися компанії, такі як 23AndMe (їх генетична діагностика за 399 $ - кращий винахід 2008-го року за даними журналу Time), Navigenics або DecodeMe, які використовують так звані ДНК-чіпи, для визначення генетичних характеристик подібного роду . Можливість читати цілі геноми багаторазово поліпшить Предсказательная здатності таких проектів, надійність, деталізованість і точність прогнозів, адекватність рекомендацій (Рис. 7).

Сьогодні ми ще не вміємо змінювати гени дорослих людей, але ми можемо запобігти багатьом генетичні захворювання, якщо будемо знати причину і почнемо завчасне лікування, профілактику. Так дослідження гена, пов'язаного з прогресуючою формою міопатії, процесів при його прочитанні в клітці, дозволили розробити ліки, які рятують тих, хто в іншому випадку був би приречений. Геноміка же відкриває дорогу індивідуальному підходу до лікування. Людей з різними генами слід лікувати по-різному: комусь допоможе одні ліки, комусь інше і це важливо знати.

Безумовно, такі можливості породять нові соціальні, етичні та філософські проблеми. Медичні страхові компанії можуть захотіти інформацію про геном клієнтів, щоб вирішити чи вигідно їм дати страховку - зробити їм знижку для людини, який генетично обіцяє бути здоровим або змусити потенційного хворого платити за страховку більше? Чи правильно це? Чи не слід спортсменам змагатися в різних вагових категоріях по алеях генів, пов'язаних з фізичною підготовкою, так само як боксери легкого ваги не б'ються з тими, хто в тяжкому? Чи можна використовувати генетичну інформацію, щоб віддати перевагу тому чи іншому співробітнику компанії в підвищенні або влаштуванні на роботу? У США подібна дискримінація вже заборонена, однак армія США проводить свої генетичні аналізи. Чи можна змінювати гени людей, коли вони спочивають в формі заплідненої яйцеклітини або зиготи? Уже сьогодні знання генів допомагають вибирати найбільш здорових зародків при штучному заплідненні.

У будь-якому випадку, як показує історія останніх десятиліть, розвиток цих технологій неминуче, як неминуче те, що коли-небудь вони стануть, доступні (якщо не обов'язкові) для всіх людей. Нам же залишається за малим: готується до прийдешніх змін і брати участь в їх маніфестації.

Мал. 6 Наші знання про людину до геноміки.

Мал. 7 Наші знання про людину в епоху геноміки

1. Rothemund PW: Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature 2006, 440 (7082): 297-302.
   
2. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H: Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, 51 Pt 1: 263-273.
   
3. Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS, Bemben LA, Berka J, Braverman MS, Chen YJ, Chen Z et al: Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 2005, 437 (7057): 376-380.
   
4. Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, Lin X, McCutcheon JP, Rosenbaum AM, Wang MD, Zhang K, Mitra RD, Church GM: Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome . Science 2005, 309 (5741): 1728-1732.
   
5. Bennett ST, Barnes C, Cox A, Davies L, Brown C: Toward the 1,000 dollars human genome. Pharmacogenomics 2005, 6 (4): 373-382.
   
6. Harris TD, Buzby PR, Babcock H, Beer E, Bowers J, Braslavsky I, Causey M, Colonell J, Dimeo J, Efcavitch JW et al: Single-molecule DNA sequencing of a viral genome. Science 2008, 320 (5872): 106-109.
   
7. Eid J, Fehr A, Gray J, Luong K, Lyle J, Otto G, Peluso P, Rank D, Baybayan P, Bettman B et al: Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science 2009 323 (5910): 133-138.

scinquisitor